MONTES, C. CUADRILLERO, AND D. VILELLA

Centro de Investigación Básica -Merck Research Laboratories, Merck, Sharp & Dohme de España, S.A., Josefa Valcárcel 38, E-28027 Madrid, España J. Med. Entomol. 39(4): 675-679 (2002)

RESUMEN: La técnica de mantenimiento in vitro descrita en este artículo ha sido utilizada exitosamente para criar Cimex lectularius (L.), chinches de cama,  alimentando todos los estadios ninfales y adultos por más de dos años mediante parafilm “M”, sellado película sellada con distintos tipos de sangre. Utilizando esta técnica de alimentación, la producción de huevos subsecuente de hembras de chinches de la cama fue extraordinariamente alta. La sangre fue mantenida a 37 C para potenciar la adhesión de las chinches de cama. Se investigó el efecto de los métodos de anticoagulación y se encontró que la sangre heparinizada era la más adecuada para alimentar a las chinches de cama. Todos los estadios de chinches de la cama alimentados semanalmente con sangre en el sistema artificial se mantuvieron adheridas hasta 0.5 – 1 h, hasta que completaron su alimentación de sangre, y todos alcanzaron los pesos de ingurgitación. Más del 90% de las chinches de cama se alimentaron artificialmente de sangre completa mudaron y pusieron huevos con éxito.
KEY WORDS: Cimex lectularius, alimentación artificial, chinches de cama

Traducción del artículo: Maintenance of a Laboratory Colony of Cimex lectularius (Hemiptera: Cimicidae) Using an Artificial Feeding Technique

El cultivo de parásitos en laboratorio y los estudios sobre patógenos transmitidos por las garrapatas y los insectos han dependido del uso de animales experimentales (Bailey 1960, Branagan 1969, Norval et al. 1992). La chinche de cama, Cimex lectularius (L.), es un parásito chupador de sangre común en climas templados y subtropicales que ataca humanos, aves y otros mamíferos (Kettle 1995). Aunque no se han relacionado con la transmisión de alguna enfermedad, se ha demostrado que puede ser vector de los organismos causantes de la peste, fiebre recurrente, tularemia, fiebre Q y hepatitis B (El-Masry y Kotkat 1990). La transmisión de la hepatitis es teóricamente posible por la contaminación al aplastar el insecto, contaminación con heces infectadas, o regurgitación durante la picadura (Jupp et al. 1983). La transmisión de los tripanosomas se ha demostrado para murciélagos (Gardner y Molyneux 1988). Durante décadas, este parásito se ha usado como modelo experimental, representando artrópodos, para detectar las actividades de ectoparásitos de diferentes fármacos ensayados. La necesidad de una producción económica de grandes cantidades de esta especie en edades sincronizadas para estudiar la infección y del ciclo de vida, así como para la realización de pruebas de detección de insecticidas para fines de control, nos llevó a desarrollar un método de alimentación con sangre mediante una membrana artificial eficaz y uniforme que podría alimentar a los cinco estadios.

El uso in vitro de técnicas de alimentación para la cría en masa y el mantenimiento de ectoparásitos tiene grandes ventajas en términos de conveniencia, productividad y el gasto financiero en lugar de la alternativa de los procedimientos in vivo (Sonenshine 1991). Este trabajo describe el desarrollo de una técnica de alimentación por membrana que permite la producción a gran escala de C. lectularius, alimentando todos los estadios con sangre fresca heparinizada de pollo a través de una película de sellado Parafilm (Laboratory Film, American National Can, Green-wich, CT).

Materiales y Métodos

Colonia de chinches de cama. C. lectularius (Figs. 1A y B), se obtuvieron de BASR (Investigación Básica de Ciencia Animal), Merck Research Laboratories (Rahway, NJ), donde estos parásitos fueron alimentados con la sangre de cobayas más de diez años.

La colonia se mantuvo elevada, alimentada en frascos de boca ancha (20 cm de alto por 8 cm de diámetro) que contiene tiras de papel de filtro. Los frascos (dos o tres por cada etapa de la colonia) se cubrieron con tela de malla fina para ventilación, que se mantuvo en su lugar con una banda elástica. Los insectos fueron separados en función del estadio y los tarros, mantenidos a una temperatura constante de 28 º C y 70% RH en una incubadora no iluminada como se describe por Schwan et al. (1991) para criar Ornithodoros moubata (Murray, 1877).

Para anestesiar para un fácil manejo los insectos se utilizó una fuente de CO2. De 7 – 8 días después de cada comida, las hembras adultas depositaron sus huevos en las tiras de filtro de papel. Los huevos eclosionaron en 5 – 7 días. Se separaron los diferentes estadios después de cada muda y estas fueron quitadas.

Cada estadio mudó al estadio siguiente en 5 – 7 días después de alimentarse con sangre. En ese momento estuvieron listos para la próxima comida de sangre. Todos los grupos de estadio fueron alimentados cada semana.

Fig. 1. (A) Cimex lectulariussin alimentarse. (B) Cimex lectularius repleta.

Fig. 1. (A) Cimex lectulariussin alimentarse. (B) Cimex lectularius repleta.

Alimentación sanguínea de chinches. Se probó el efecto de los métodos de anticoagulación para la harina de sangre. Se utilizaron cuatro diferentes tipos de sangre: sangre heparinizada recién extraída de pollos y ganado vacuno, sangre desfibrinada comercial de cordero (Oxoid, SA), y sangre heparinizada de cordero (Soria Melguizo). En nuestras condiciones, el ciclo de vida desde la eclosión de los huevos a la etapa adulta duró entre 35 y 45 días.

Sistema de alimentación artificial. El aparato de alimentación (a medida por Afora, SA) consistió en un recipiente de vidrio con la membrana Parafilm “M” colocada en la parte inferior (Figs. 2 y 3). La membrana se estira para mantenerla en su lugar y facilitar la alimentación. Para aumentar la adhesión de las chinches, la sangre, alrededor de 4-5 ml por alimentador, se mantuvo a 37 º C usando un baño caliente con una bomba para hacer circular el agua a través de los alimentadores de vidrio. Las chinches fueron alimentadas con los tipos de sangre respectivos hasta que estuvieron repletas y se habían separado de la película de sellado.

Las tiras de papel fltro (Ref Albet. 101/240) tienen que ser colocadas de tal manera que garanticen el contacto directo con el revestimiento del frasco, para permitir que los insectos lleguen a la harina de sangre a través de la tela de malla y la membrana de parafilm. Es esencial que todas las partes de la membrana estén en contacto con la sangre, de modo que los insectos al insertar sus partes bucales puedan encontrar sangre en lugar de bolsas de aire. Todos los estadios de C. lectularius fueron alimentados con los distintos tipo de sangre una vez a la semana. El sistema permite el uso de cuatro a seis alimentadores de vidrio dispuestos en paralelo en todo momento.

Fig. 2.(A) Sistema de alimentación artificial. (B) Alimentación artificial en detalle

Fig. 2.(A) Sistema de alimentación artificial. (B) Alimentación artificial en detalle

Resultados

Se estableció y mantuvo una nueva colonia de C. lectularius más de 2 años, a partir de las ninfas de cuarta etapa. La alimentación artificial a través de la película de sellado Parafilm “M” fue el único método utilizado para alimentar las diferentes etapas de desarrollo de este parásito. Cada semana se alimentaron todas las etapas y se obtuvieron nuevos huevos.

Todas las etapas de chinches se alimentaron de la sangre en el sistema de alimentación artificial permaneciendo unidas hasta 0.5-1.0 h, hasta finalizar su alimentación de sangre y la mayoría de ellas alcanzaron el peso de ingurgitación. Se les reconoce fácilmente por sus cuerpos hinchados. Pocas chinches tomaron sólo una comida parcial de sangre (Fig. 1B).

No hubo chinches unidas a la membrana cuando la sangre estuvo a temperaturas inferiores a 35ºC; por lo tanto, la sangre se mantuvo a una temperatura constante de 37 º C para facilitar la atracción de las chinches.

Las ninfas y adultos lograron una mejor ingurgitación y un mayor número de huevos cuando fueron alimentados con sangre entera con heparina como anticoagulante que con sangre desfibrinada. Se utilizó sangre de tres animales distintos: vacuno, ovino y pollo. Se obtuvieron idénticos resultados cuando la sangre se incorporó a partir de fuentes comerciales o se extrajo recientemente y el anticoagulante usado fue heparina. En cada experimento de alimentación, la velocidad de alimentación promedio de diferentes estadios fue 90-100% cuando se utilizaba como dieta la sangre heparinizada fresca.

Fig. 3. Diagrama del sistema de alimentación artificial

Fig. 3. Diagrama del sistema de alimentación artificial

Cuando se utilizó sangre comercial de cordero desfibrinada, la producción de huevos disminuyó de manera tan dramática que era imposible obtener una nueva generación.

Discusión

Comenzamos nuestra colonia de C. lectularius de ninfas de cuarto estadio donados por nuestros colegas de Rahway, NJ. Le Sueur et al. (1993) obtenidas de algunas de sus colonias (por ejemplo, C. lectularius) de otros entomólogos, y consideraron que eran muy importantes las adaptaciones a nuevas fuentes de alimento como conejillos de indias anestesiados. Estas técnicas in vivo y los experimentos derivados de ellos son caros, imprecisos, normalmente requieren de instalaciones de retención y causan incomodidad en el animal experimental. Mediante el desarrollo de las técnicas de alimentación in vitro, es posible eliminar en gran medida la necesidad de utilizar animales vivos de experimentación.

Este estudio reporta el mantenimiento del ciclo de vida de C. lectularius durante más de 2 años usando alimentación artificial. Schwan et al. (1991) reportaron la alimentación artificial de O. moubata utilizando una membrana Parafilm; sin embargo, el diseño de su aparato difiere del nuestro. Un alimentador artificial muy similar fue descrito por García et al. (1975) para el mantenimiento de Rhodnius prolixus.

En nuestro estudio, ninfas y adultos obtuvieron mejores pesos de ingurgitación cuando se alimentaron de sangre entera con heparina como anticoagulante que con sangre desfibrinada. Observaciones similares fueron reportadas con Amblyomma variegatum (F.) por Voigt et al. (1993).

Moloo (1971) informó de que la temperatura de la sangre es uno de los factores más críticos en la alimentación por membrana de Glossina. Wallade et al. (1991) mantuvieron un baño de agua a 42 º C para calentar la comida de sangre y las membranas a 37 º C, porque suponían que el gradiente de temperatura era un factor importante para unir las garrapatas a la membrana. En nuestro estudio, se reprodujeron estas condiciones y se obtuvo una alimentación eficiente.

Pagot et al. (1973) llevaron a cabo ensayos de alimentación artificial de otros insectos, Glossinidae, a través de una membrana de silicona sintética. Estas membranas químicamente inertes tienen cualidades físicas que les permiten ser esterilizadas a altas temperaturas y conservarlas indefinidamente. Aunque las membranas Parafilm no pueden ser esterilizadas, el coste es tan bajo que se puede utilizar una nueva membrana cada vez. Slama y Williams (1966) describen la acción del “factor de papel” como un inhibidor del desarrollo embrionario de la chinche de cama europea; en contraste, no se observó ningún efecto derivado de las tiras de papel de filtro.

Este sistema de alimentación artificial se podría aplicar para mantener diferentes ciclos de vida de otros artrópodos hematófagos. Por ejemplo, en nuestro laboratorio, todas las etapas del ciclo de vida de Ornithodoros erraticus (Lucas, 1849) se alimentaron con este método. Este parásito se está utilizando para detectar nuevos fármacos con actividad contra las garrapatas blandas en un nuevo modelo de ratón.

Referencias citadas

  • Bailey, K. P.  1960.  Notes on the rearing of Rhipicephalusappendiculatus and their infection with Theileria  parva for experimental transmission. Bull. Epiz. Dis. Afr. 8: 33-34.
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  • ElMasry, S. A., and A. M. Kotkat.  1990.  Hepatitis B surfaceantigen in Cimex lectularius. J. Egypt. Publ. Health Assoc. 65(3-4): 229-236.
  • Garcia, E. S., J. D. Macarini, M.L.M. Garcia, and F. B. Ubatuba.  1975.  Alimentacao de Rhodnius prolixus no Laboratorio. An. Acad. Brasil. Dienc. 47(3/4): 537-545.
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Recibido para publicación el 13 de octubre de 2000; aceptado el 11 de febrero de 2002.

Sobre El Autor

Experto en TerMiTaS, David Mora

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